RetroBeads™逆向示蹤熒光微粒是Lumafluor 公司特色的逆向示蹤產(chǎn)品，且是目前文獻(xiàn)證實(shí)有效的示蹤微粒（該產(chǎn)品的有效性經(jīng)數(shù)百篇從無(wú)脊椎動(dòng)物到哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究論文證實(shí)），  該示蹤產(chǎn)品體內(nèi)注射高度集中不易擴(kuò)散，信號(hào)強(qiáng)，對(duì)活細(xì)胞或活體無(wú)毒，且存留時(shí)間大于一年，與大多順向示蹤劑、原位雜交檢測(cè)技術(shù)、免疫組化技術(shù)兼容。

Lumafluor紅色 Red RetroBeads操作說(shuō)明

一、包裝與稀釋：

  Lumafluor 的beads包裝于一支密封的小管內(nèi)，內(nèi)含的濃縮beads懸浮于蒸餾水中。如使用紅色Beads作為神經(jīng)通路的逆向示蹤，其稀釋方法推薦采用：大鼠視皮層內(nèi)可采用1：4比例進(jìn)行稀釋而不減少Beads的熒光標(biāo)記強(qiáng)度和質(zhì)量。然而對(duì)于實(shí)驗(yàn)我們不推薦使用稀釋的Beads而使用原液進(jìn)行注射示蹤。除蒸餾水外，常規(guī)的鹽溶液如NaCl、KCl溶液也可作為稀釋液。如使用綠色Beads，則強(qiáng)烈建議使用原液，無(wú)需稀釋。

二、溫度儲(chǔ)存:

   為避免蒸發(fā)，Bead溶液應(yīng)存放于冰箱內(nèi)4度冷藏，切忌勿冷凍！ 冷凍的Beads將失去效用，無(wú)法使用。而變干的beads同樣也無(wú)法使用（無(wú)法重懸），該產(chǎn)品建議一年內(nèi)用完。

三、注射：

   Beads使用壓力注射，如1 mlHamilton微量注射器或氣壓注射系統(tǒng)，如需小區(qū)域微量注射(30-50 nl)，可采用末端30-50 um直徑的玻璃電極注射，而常規(guī)的逆向示蹤（注射量0.1-0.3 ul）可使用更大直徑的玻璃電極。盡管如此，即使注入更大的劑量，Beads，也不會(huì)明顯從注射位點(diǎn)擴(kuò)散（通常擴(kuò)散距離少于1mm），因此，為盡量充分標(biāo)記投射到一個(gè)較大神經(jīng)核團(tuán)的神經(jīng)元，需使用多點(diǎn)注射。盡管Beads帶有負(fù)電荷，但是不建議采用離子滲透法注入示蹤Beads。

四、存活時(shí)間：

   在大多數(shù)恒溫脊椎動(dòng)物系統(tǒng)中，檢測(cè)Beads的時(shí)間推薦為1周。目前并未檢測(cè)Beads的zui長(zhǎng)可檢測(cè)期，然而在Beads的熒光強(qiáng)度和質(zhì)量至少可保持在體內(nèi)14個(gè)月以上不變，而細(xì)胞可能會(huì)被yongjiu標(biāo)記。目前并未發(fā)現(xiàn)Beads在動(dòng)物或神經(jīng)元中表現(xiàn)出毒性作用的報(bào)道。

五、固定和處理：

   準(zhǔn)的固定方法是：0.1 M PBS沖洗或灌注后在4%的多聚甲醛（0.1 M PBS配制，pH 7.4）中固定，用戊二醛固定會(huì)產(chǎn)生大量的組織自發(fā)熒光，妨礙Beads標(biāo)記的神經(jīng)元，并且綠色Beads在戊二醛固定的組織中將根本觀察不到，因此應(yīng)盡量避免采用。如采用冰凍切片，切片應(yīng)用PBS漂洗后用明膠包被的載玻片貼片晾干，在充分風(fēng)干后，再用二甲苯透明1分鐘，然后用熒光封片劑（Fluoromount或Krystalon）封片。Fluoromount可從Atomergic Chemetals Corp., （Farmingdale, NY）公司購(gòu)買; Krystalon可從Harleco (EM Industries，Gibbstown, NJ）購(gòu)買（靶點(diǎn)科技有售）。切片只可短期暴露在乙醇或二甲苯中，但是長(zhǎng)時(shí)間暴露（大于5分鐘）會(huì)損壞Beads。Beads 對(duì)甘油非常敏感，在甘油環(huán)境中熒光會(huì)迅速萃滅，因此切忌使用甘油類封片劑，如無(wú)法避免，還可采用水楊酸甲酯代替甘油作為封片劑。封片后的切片如存放于黑暗環(huán)境中，熒光Beads標(biāo)記的細(xì)胞可保持一年不萃滅（但是切片的自身熒光背景會(huì)增加）。迄今為止，還沒(méi)有成功采用塑膠材料包被Beads標(biāo)記的組織的記錄。

六、成像觀察:

   紅色Beads中的染料為羅丹明，因此所有與羅丹明匹配的熒光濾鏡均可使用，部分老的尼康公司的羅丹明濾鏡因背景較高，可能導(dǎo)致無(wú)法觀察到熒光Beads，通常Zeiss 和Leitz的標(biāo)準(zhǔn)羅丹明濾鏡可獲得較好的觀察效果。而大多綠色熒光濾鏡均可較好地觀察綠色Beads的熒光結(jié)果，設(shè)置為熒光黃的濾鏡可獲得較強(qiáng)的明亮熒光，但是同時(shí)也帶來(lái)較高的背景干擾。較寬波段的熒光濾鏡比窄波段的熒光濾鏡可以獲得更強(qiáng)的熒光信號(hào)。在長(zhǎng)時(shí)間的觀察和拍照下Beads的熒光也不會(huì)淬滅。

 在低倍數(shù)或低數(shù)值孔徑物鏡下(如 X4, X10)通常難以觀察到Bads的熒光信號(hào)，只有細(xì)胞被顯著標(biāo)記，X10的油鏡（數(shù)值孔徑大于0.4）或者更大倍數(shù)的物鏡才可觀察到。通常情況下，X 25的油鏡可以清晰地觀察到低倍鏡下無(wú)法觀察到的標(biāo)記細(xì)胞。物鏡的選用對(duì)綠色熒光Beads尤其重要。在做出實(shí)驗(yàn)失敗的決定前（在目標(biāo)區(qū)域無(wú)法觀察到標(biāo)記細(xì)胞），可先用油鏡仔細(xì)觀察注射位點(diǎn)附近的細(xì)胞是否被標(biāo)記，此處應(yīng)該觀察到大量的標(biāo)記細(xì)胞。

  對(duì)使用綠色熒光Beads標(biāo)記的額外提醒：目前已發(fā)現(xiàn)綠色熒光Beads在年青動(dòng)物比年老動(dòng)物中標(biāo)記更為理想的情況，此外，年青動(dòng)物的組織自發(fā)熒光（背景）也更低，因此，假如可以的話，在使用綠色熒光Beads做逆向標(biāo)記實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)盡量使用年輕動(dòng)物。

  因?yàn)榫G色熒光Beads的激發(fā)光段比紅色熒光Beads短，因此組織自發(fā)熒光是個(gè)問(wèn)題，因此，應(yīng)采用減少自發(fā)熒光的步驟以獲得更理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這些方法有：（1）使用更薄的切片，如30微米比40或50微米理想；（2）使用年青的動(dòng)物；（3）封片后立即觀察拍照（隨著時(shí)間增加背景也會(huì)增加）。